2016年8月20日/生物谷BIOON/--CRISPR-Cas9是一種用于在人細(xì)胞系中進(jìn)行基因敲除來發(fā)現(xiàn)它們的基因所發(fā)揮何種功能的流行技術(shù)，但是讓基因失去功能的效率存在非常大的差異。
如今，在一項(xiàng)新的研究中，來自美國加州大學(xué)伯克利分校的研究人員在大多數(shù)類型的人細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)一種方法讓CRISPR-Cas9切割靶基因和讓它們失去功能的效率提高高達(dá)5倍，從而能夠更加容易構(gòu)建和研究基因敲除細(xì)胞系以及潛在地作為一種人類療法讓一個(gè)發(fā)生突變的基因失去功能。相關(guān)研究結(jié)果于2016年8月17日在線發(fā)表在Nature Communications期刊上，論文標(biāo)題為“Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes”。
科學(xué)家們不斷發(fā)現(xiàn)新的基因或它們編碼的蛋白，但是很難發(fā)現(xiàn)它們在體內(nèi)或在疾病中發(fā)揮的作用。發(fā)現(xiàn)這種作用的關(guān)鍵是讓基因失去功能來觀察當(dāng)它被移除時(shí)會發(fā)生什么。
盡管CRISPR-Cas9能夠加快制造基因敲除細(xì)胞系的過程，但是人們有時(shí)必需制造和篩選許多這種基因編輯器的變異體以便發(fā)現(xiàn)哪一種發(fā)揮得更好。在這項(xiàng)研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)只需經(jīng)過簡單調(diào)整一下就能夠更加有效率地開展這個(gè)過程。
關(guān)鍵就是與CRISPR-Cas9分子一起被導(dǎo)入人細(xì)胞中的短片段DNA不與人基因組中的任何DNA序列相匹配。這些短片段DNA被稱作寡核苷酸，似乎干擾人細(xì)胞中的DNA修復(fù)機(jī)制，從而將比較普通的CRISPR-Cas9的基因編輯效率提高2.5到5倍。
論文通信作者、加州大學(xué)伯克利分校創(chuàng)新基因組計(jì)劃科技總監(jiān)、分子與細(xì)胞生物學(xué)兼任助理教授Jacob Corn說，“它表明如果你做了非常簡單的事情---只是將廉價(jià)的與人基因組不存在任何同源性的人工合成寡核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞中，那么基因編輯效率提高多達(dá)5倍?！边@種技術(shù)提高所有CRISPR-Cas9的編輯效率，即便是初始時(shí)完全不會起作用的那些CRISPR-Cas9。
利用這種更高的基因編輯效率，研究人員將會更加成功地構(gòu)建他們想要的基因敲除細(xì)胞系，隨后利用這些基因敲除細(xì)胞系研究一個(gè)基因或一組基因的功能。鑒于大多數(shù)壽命長的人細(xì)胞系起源自癌細(xì)胞---包括非常流行的HeLa細(xì)胞系，這些細(xì)胞系通常含有多于正常時(shí)每個(gè)基因的兩個(gè)拷貝。這就使得一次敲除所有拷貝比較困難，因而更高的基因編輯效率會極大地增加這種成功機(jī)會。
當(dāng)通過基因敲除校正人體內(nèi)的遺傳性基因突變時(shí)，較高的基因編輯效率也是必不可少的。醫(yī)生們猜測可將讓人們?nèi)菀谆忌螦IDS等傳染性疾病或者自身免疫疾病、炎性疾病或神經(jīng)退行性疾病的基因敲除掉。Corn和同事們描述的這種方法是否能夠用于疾病治療仍需拭目以待，但是就研究而言，它是非常有效的。
DNA修復(fù)是CRISPR-Cas9成功的關(guān)鍵
CRISPR-Cas9分子是由被稱作Cas9的蛋白剪刀和一種引導(dǎo)Cas9結(jié)合到DNA靶位點(diǎn)并在那里進(jìn)行切割的向?qū)NA（gRNA）組成的。這種技術(shù)依賴于以下一個(gè)事實(shí)：當(dāng)切割靶基因上的特異性DNA序列時(shí)，細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制并不總是重建這種DNA鏈，而是在這種DNA序列上產(chǎn)生錯(cuò)誤，從而讓這種基因失去功能和破壞它的活性。
這種gRNA是一種長20nt的RNA短鏈，與靶基因上的DNA序列互補(bǔ)。它結(jié)合到這種DNA序列上，讓Cas9切割這種雙鏈DNA。
為何一些gRNA發(fā)揮很好，讓Cas9能夠?qū)⒔?00%地切割靶基因并讓它失去功能，然而其他的gRNA能夠結(jié)合到靶基因上，但是很少或從不會敲除它？自從這個(gè)技術(shù)在2012年被來自加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer Doudna和來自瑞典于默奧大學(xué)的Emmanuelle Charpentier發(fā)明以來，這一直就是個(gè)秘。Corn說，這種切割效率隨著細(xì)胞類型和特定細(xì)胞系的不同而發(fā)生變化。
